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時(shí)間:2022-10-26 來(lái)源:admin 點(diǎn)擊:840次
臨床微生物實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常能夠分離到一些有意義的菌種,但接種在平板上的細(xì)菌放4℃冰箱只能保存數(shù)天,并且細(xì)菌在培養(yǎng)基上移種3次后,其形態(tài)、菌落、毒力等均易發(fā)生變異,監(jiān)測(cè)日常工作的室內(nèi)質(zhì)控用標(biāo)準(zhǔn)菌株也需要長(zhǎng)期留存。所以盡可能長(zhǎng)期有效地留存菌種對(duì)于系統(tǒng)地分析當(dāng)前流行株的生物學(xué)、分子生物學(xué)特征及耐藥性變遷,醫(yī)院感染病原學(xué)調(diào)查、新藥臨床研究都十分重要的意義。
一、常規(guī)保存法
該法操作簡(jiǎn)單,只需普通冰箱保存,每個(gè)臨床微生物實(shí)驗(yàn)室均可采用。但缺點(diǎn)是留存時(shí)間短,傳代頻繁,菌種易變異。
二、半固體穿刺保存法
用穿刺接種法將細(xì)菌培養(yǎng)物接種于半固體培養(yǎng)基內(nèi),經(jīng) 3718-24h培養(yǎng)后,加一層無(wú)菌的液體石蠟,厚度約為 1cm,置冰箱保存。腸道桿菌及葡萄球菌等,一般可保存3-6個(gè)月。當(dāng)需傳代移種時(shí),將半固體菌種管傾斜使液體石蠟流至一邊,再取菌移種于新的培養(yǎng)基。將沾有少量液體石蠟的接種環(huán)浸于 95%酒精中片刻,再燒灼以免直接在酒精燈上燒灼時(shí),液體石蠟四處濺散而引起污染。如保存副溶血性弧菌可加入NaCl制成3.5%高鹽半固體,在室溫下可保存 1個(gè)月。
三、斜面保存法
普通瓊脂斜面保存法:葡萄球菌、腸道桿菌等對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高的一股細(xì)菌可接種于普通瓊脂斜面上,斜面底部應(yīng)加少許無(wú)糖肉膏液,以防干涸 (但變形桿菌"OX"及傷寒桿"O"菌株宜接種于干燥的瓊脂斜面以防變異)。用橡皮塞塞緊,經(jīng)3718-24h培養(yǎng)后,存放于 4冰箱中,一般可保存3-6個(gè)月。
血液瓊脂斜面保存法:鏈球菌及肺炎球菌等對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高的細(xì)菌應(yīng)接種于血液瓊脂斜面上,37培養(yǎng)生長(zhǎng)后,放4冰箱保存。鏈球菌須半個(gè)月至1個(gè)月移種一次,肺炎球菌則須 4d移種一次。
雞蛋斜面保存法:將細(xì)菌接種于雞蛋斜面上,經(jīng) 3718-24h培養(yǎng)后,加無(wú)菌液體石蠟至斜面浸液,再超出約1cm,置4冰箱保存。此法用于保存含有Vi抗原的沙門(mén)氏菌及其它含表面抗原的細(xì)菌,可保存3-6個(gè)月。
呂氏血清斜面:白喉棒狀桿菌可保存在該培養(yǎng)基上,其成份為 1 %葡萄糖肉湯 (pH7.4) 1份,無(wú)菌牛血清或兔血清3份。白喉棒狀桿菌在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速、旺盛,菌體形態(tài)典型,如在培養(yǎng)基中再加入5%-10%的中性甘油,則培養(yǎng)出的白喉棒狀桿菌異染顆粒更為明顯,單24小時(shí)后即衰老成為多形態(tài),很少有異染顆粒,菌體粗大3-4倍,置4可保存2周至1個(gè)月。
四、砂土管保存法
適用于產(chǎn)芽孢的細(xì)菌
將過(guò)篩后的中性細(xì)砂烘干,裝入小試管內(nèi)約lcm高,塞以棉塞,烘干備用。用無(wú)菌生理鹽水洗下培養(yǎng)基上的細(xì)菌培養(yǎng)物,制成菌懸液。然后吸此菌懸液約0.5ml注入砂土管內(nèi),以砂土全部浸濕為度。塞好棉塞,放入干燥器內(nèi)抽干。然后放在裝有氯化鈣(吸水劑)的干燥瓶?jī)?nèi),置冰箱保存?zhèn)溆?。需用時(shí)可取一接種環(huán)砂土接種于適宜培養(yǎng)基上培養(yǎng)即可。
五、低溫冷凍保存法
實(shí)驗(yàn)室須配備-20以下低溫冰箱,冰箱溫度越低,保存的時(shí)間越長(zhǎng)。
六、濾紙片低溫冷凍保存菌種方法
將新華濾紙片剪成3mm×3mm,經(jīng)高壓蒸汽置無(wú)菌器皿中備用,0.5ml無(wú)菌帶蓋塑料離心管。將待保存菌種在血平板上分離純化后,用無(wú)菌小鑷子夾住濾紙片,在平板上刮取多量細(xì)菌,放在塑料離心管內(nèi),1只離心管中可放數(shù)十片帶菌濾紙片,然后蓋上蓋子,用膠布將蓋口封嚴(yán),注明患者姓名,菌名及保存日期等以備查找。將塑料管放在-70冰箱內(nèi)保存。使用時(shí)將菌種分別從塑料離心管中取出1片,放入增菌肉湯中,35孵育18~24h,再將菌懸液移種于血平板上。本方法適于保存對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高的細(xì)菌,而不適于苛養(yǎng)菌的保存。
七、濕牛奶冷凍法
材料 保護(hù)劑牛奶的準(zhǔn)備:新鮮牛奶經(jīng)脫脂棉反復(fù) 3次過(guò)濾后,10磅10min高壓蒸氣后,冰箱保存?zhèn)溆?。菌種管的處理:先經(jīng)清潔液浸泡1天,之后用清水沖洗,再用蒸餾水浸泡過(guò)夜,以達(dá)中性,然后管口塞上棉花,經(jīng)15磅30min高壓蒸氣備用。
方法 將各種細(xì)菌種于各自生長(zhǎng)良好的平板培養(yǎng)基上,經(jīng)分純后在37孵箱孵育18h后,用準(zhǔn)備好的保護(hù)劑牛奶洗下菌苔,然后用無(wú)菌毛細(xì)滴管吸取菌懸液滴入菌種管球部,每管球部約有一半的菌液,之后火焰封口,保存于-20冰箱。抵抗強(qiáng)的細(xì)菌至少可保存3年,抵抗力弱的細(xì)菌保存不低2年。
八、細(xì)菌鑒定卡保存菌種
本法適用于使用VITEK全自動(dòng)微生鑒定儀的實(shí)驗(yàn)室。方法是將鑒定卡標(biāo)注后直接放置-20冰箱保存,復(fù)蘇時(shí)將鑒定卡直接從-20移至35,待小孔液體完全融化后,以無(wú)菌手續(xù),用注射器抽吸出陽(yáng)性生長(zhǎng)孔內(nèi)的液體,點(diǎn)種于合適平板,置35孵箱內(nèi)24~48小時(shí)即可。該法生化卡內(nèi)的細(xì)菌反復(fù)凍融 5次,分離出的細(xì)菌效果相同。葡萄球菌屬、腸桿菌屬、念珠菌屬存活時(shí)間不小于29個(gè)月;腸球菌屬、黃桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬存活時(shí)間不小于21個(gè)月,鏈球菌屬和假單胞菌屬存活時(shí)間不小于10個(gè)月。
九、商品化菌種保存管
每只保藏管中含20-25個(gè)小珠以及緩沖液,使用時(shí)將菌落挑入緩沖液中,混勻,將緩沖液吸去,置-70冰箱保存可達(dá)10年,-20冰箱可保存1-3年。復(fù)蘇時(shí),只需將小珠接入肉湯或平板上滾動(dòng)即可。商品化菌種保存管操作簡(jiǎn)單,但價(jià)格偏高。筆者預(yù)計(jì)隨著經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展和實(shí)驗(yàn)室條件的改善,使用的單位將會(huì)越來(lái)越多。
十、冷凍真空干燥保存法
該法是目前保存菌種的方法,具有如下幾個(gè)突出的優(yōu)點(diǎn):適用范圍廣。除少數(shù)不產(chǎn)生孢子只產(chǎn)生菌絲體的絲狀真菌不宜采用此方法保藏外,其他各大類(lèi)微生物如細(xì)菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌及病毒均可采用此方法保藏;保藏期長(zhǎng),成活率高。有人報(bào)道保藏在真空冷凍干燥安培管中的真菌成活期長(zhǎng)達(dá)40多年,一般微生物至少可保存10余年;微生物在保藏期內(nèi)可避免其它雜菌污染;便于攜帶運(yùn)輸,易實(shí)現(xiàn)商品化生產(chǎn)。其缺點(diǎn)為需要一定的設(shè)備(冷凍真空干燥機(jī))、操作繁瑣等。菌種管由傳統(tǒng)的玻璃菌種管改為0.5ml帶蓋塑料離心管。方法:將塑料離心管置耐高壓塑料離心管盒內(nèi)并用雙層報(bào)紙包好,高壓蒸汽15磅15min消毒,放烤箱80烤干。在凈化工作臺(tái)內(nèi)將脫脂牛奶洗下的濃厚菌懸液用長(zhǎng)毛細(xì)玻璃滴管加到塑料離心管的底部,每只0.2ml左右,切記不要將牛奶污染離心管口。將加好菌液的離心管盒置-20冰箱預(yù)凍,預(yù)凍好后把離心管盒放置到冷凍干燥機(jī)干燥箱內(nèi)凍干。凍干后在凈化工作臺(tái)內(nèi)壓好離心管蓋,不抽真空。貼標(biāo)簽,用封口膜封離心管口。放-20冰箱保存。